DiO(細(xì)胞膜綠色熒光探針)染色方法！

DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來(lái)染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，這類(lèi)染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命。一旦對(duì)細(xì)胞染色，這類(lèi)染料在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散，*濃度時(shí)可以使整個(gè)細(xì)胞膜染色。它們的熒光顏色區(qū)分明顯：DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR（深紅色熒光）這使得他們可以用來(lái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行多色成像和流式分析。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC和TRITC的濾光片。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，在細(xì)胞和組織染色中更有價(jià)值。 DiR的紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織，在活體成像中用來(lái)示蹤。

使用方法

1. DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細(xì)胞膜染色液制備
（1）配置DMSO或EtOH 儲(chǔ)存液：儲(chǔ)存液用 DMSO或EtOH配置濃度1～5 mM。
注意：未使用的儲(chǔ)存液保存在-20℃，避免反復(fù)凍融。
（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無(wú)血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲(chǔ)存液，配制濃度為1～
5 µM的工作液。
注意：工作液的終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來(lái)配制。可以從推薦濃度的十倍以上尋找*條件。

DiO(細(xì)胞膜綠色熒光探針)染色方法！

2. 懸浮細(xì)胞染色
（1）懸浮細(xì)胞密度為 1 × 10^6/mL加入到工作液中。
（2）在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2～20分鐘，不同的細(xì)胞*培養(yǎng)時(shí)間不同。
（3）染色細(xì)胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。
（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。
（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。

3. 粘壁細(xì)胞的染色
（1）使粘壁的細(xì)胞在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過(guò)量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。
（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
（4）在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 2～20分鐘，不同的細(xì)胞*培養(yǎng)時(shí)間不同。
（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基

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