明膠酶譜試劑盒操作時要如何進(jìn)行優(yōu)化

信帆生物的明膠酶譜試劑盒，主要用于檢測MMP2，MMP9的活性，適用樣本多樣，包括細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞上清液，全血等樣本，操作和WB免疫印跡差不多，產(chǎn)品現(xiàn)貨供應(yīng)！

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。

凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

實驗中的小知識分享給大家：

1.做酶譜要測定樣品蛋白的濃度（同Western blot，建議用BCA法）；

2.酶譜法是測定樣品中MMP-2、9活性的，如果煮沸使蛋白變性就沒有用了，故禁忌煮沸；

3.上樣緩沖液中也不能加β-巰基乙醇，這點由western blot轉(zhuǎn)作明膠酶譜的朋友切記、切記；

4.蛋白上樣量必須保證一樣，不會出現(xiàn)一致的透明條帶，如果不能保證上樣量一致，測出的相對活性也沒有統(tǒng)計分析的意義；

5.上樣時需要注意的一點，必須在4℃環(huán)境中操作，我用的是冰臺，同時所用的蛋白樣品（-80℃冰箱）不能是以前曾解凍使用過的，必須是新取出的，因為只要解凍就會有部分酶降解，影響你的結(jié)果。此外做過一次酶譜的蛋白樣品也不要反復(fù)使用，下次應(yīng)使用其它已分裝、未解凍過的樣品；

由于明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。因為檢測蛋白活性,所以應(yīng)盡量避免蛋白變性,我們一般都要求冰上操作,電泳也放在冰水里進(jìn)行的。

這些您都記住了嗎，掌握了這些知識，在操作的時候能夠做到這些，對于您的實驗一定會事半功倍！

明膠酶譜試劑盒操作時要如何進(jìn)行優(yōu)化