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實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)代測

1.聚合酶鏈反應(yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡稱PCR。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。Real -Time PCR，即實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過Real -Time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，zui終對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來，廣泛應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。

實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)代測

2 方法

2.1 組織總RNA的提取

（1）取組織或者細(xì)胞于1mL的Trizol的勻漿管中，于勻漿機(jī)勻漿20sec，立即放于冰上；

（2）置于超凈臺中，溫育5min，12000r/min，離心10min；

（3）吸上清于新的1.5mL離心管中，加入200μL的氯仿，搖勻，室溫靜置2min，4℃，12000r/min，離心10min；

（4）吸取上清于新的1.5mL離心管中，加入600μL的異丙醇，混合均勻，室溫靜置15min，4℃，12000r/min，離心15min，棄上清；

（5）加入1mL75%的無水乙醇（750μL無水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清；

（6）加入1mL無水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清，室溫干燥10min；

（7）加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2.2 cDNA*條鏈的合成

2.2.1  總RNA中DNA的消除

37℃，30min；Hold，加1μL的EDTA；65℃，10min。

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄

（1）按以下體系加入：

反應(yīng)程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。

2.3 Real-time PCR擴(kuò)增

將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0.5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

總體積 25μL

反應(yīng)程序：

95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec；

數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

提供實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

cytochrome c mRNA擴(kuò)增動力學(xué)曲線

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